一、包被抗原
1. 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液 （pH 9.6） 溶解抗原， 使抗原浓度为 10-20 μg/ml，加 100 μ l/孔到 96 孔酶标板，4℃放置过夜。
2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μ l 1％ BSA 37℃封闭 1 小时。
3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育 2 小时。
4. PBST 洗涤 5 次后， 加入100μ l 稀释后的 HRP 标记的二抗， 37℃孵育 1 小时。
5. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A 405 吸收值。
二、包被细胞
1. 在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。
2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。
3. 加入 125 μ l/well10% Formalin（1:10 稀释），室温下固定 15 min。
4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2- 8 ℃ 备用。
5. 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。
6. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃孵育 2 小时。
7. PBST 洗涤 5 次后， 加入100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 ℃孵育 1 小时。
8. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A 405 吸收值。
① 50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na 2CO 3 0.15 克，NaHCO 3 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。
② ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：0.2M Na 2HPO 4 2.4ml ；0.1M 柠檬酸 2.6ml ；ddH 2O 5ml ；ABTS 5mg；H 2O 2(30%) 4 ul （用前加入）
注 意：
1. 一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。
2. 不同的显色系统对应不同的光吸收值。
elisa试剂盒注意事项
正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
