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名称
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品牌
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货号
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规格
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保存
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干细胞冻存液GMP级
STEM-CELLBANKER®GMP grade
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ZENOAQ
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11924
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100mL
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2至8°C或
－20℃以下
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11922
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20mL
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一、产品概述
STEM-CELLBANKER® GMP等级，预配制有10% DMSO，是一款专为干细胞长期冷冻保存设计的无血清、化学成分明确的细胞冻存液，严格遵循GMP（药品生产质量管理规范）标准生产，旨在为临床前研究及临床应用提供安全、高效、稳定的干细胞保存解决方案。该产品通过优化配方，有效减少冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，维持干细胞的高存活率、多向分化潜能及生物学活性，适用于间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSC）等多种干细胞类型的冻存。
二、产品优点
•冻融处理后，在保持细胞多能性、正常核型和增殖能力的同时，显著提高了细胞活力。
•对于在DNA和RNA水平上没有损伤的组织进行冷冻保存非常有用。
•采用高质量成分进行更安全的冷冻保存，无动物源成分污染风险，批次间保持稳定。
•配方完整，无需进一步制备，可在-80°C直接冷冻，无需可编程冷冻机等，节省成本/时间/步骤。
•严格按照JP GMP对高质量产品进行监控。
※本产品已于2013年在PMDA的MF注册，并于2013年在美国CBER（生物评估与研究中心）/FDA（美国食品和药物管理局）的BBMF注册。
三、主要成分
STEM-CELLBANKER® GMP等级的核心成分为：
•冷冻保护剂：低浓度二甲基亚砜（DMSO，终浓度5%-10%），兼具细胞膜渗透性与细胞毒性平衡；
•基础培养基：化学成分明确的无血清培养基（如DMEM/F12或MEM-α），提供细胞基础营养支持；
•渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇等，维持细胞外渗透压稳定，减少细胞脱水损伤；
•抗氧化剂：谷胱甘肽或维生素E衍生物，抑制冷冻过程中自由基对细胞的氧化损伤；
•pH缓冲体系：HEPES、碳酸氢钠等，确保冻存过程中pH值稳定在生理范围（7.2-7.4）。
所有原料均符合USP/EP/CP药典标准，且通过严格的微生物限度（<10 CFU/mL）、内毒素（<0.25 EU/mL）及重金属残留检测，确保产品安全性。
四、应用范围
（1）用STEM-CELLBANKER®对hESC和iPS细胞进行低温保存分析。
测试细胞系:HS293和HS306（hESC）；ChiPSA（人类iPS）
冷冻培养基：STEM-CELLBANKER ® vs 常规冷冻培养基（10% DMSO 在含有培养基的血清替换液中）
细胞活力评估:Try pan Blue和钙蛋白酶酯酶活死试验
结果:在HS293、HS306和ChiPSA细胞株中，细胞多能性、正常核型和增殖能力均保持显著较高的细胞存活率。
我们非常感谢奥蒂·霍瓦塔教授和弗里达·霍尔姆女士的上述分析。
（2）用STEM-CELLBANKER®对间充质干细胞（MSCs）和内皮祖细胞（EPCs）进行低温保存分析。
MSCs EPCs
STEM-CELL ® >95% >90%
测试细胞系:人类UCB衍生的MSC和EPC
冷冻介质:STEM-CELLBANKER ®
冷冻方案:细胞直接在—80°C冷冻3天，转入—192°C冷冻72天。
细胞存活率测定:色谱蓝染色法。
结果:观察到MSCs的细胞存活率高达95%以上，EPCs的细胞生存率高达90%以上，同时细胞的增殖能力和分化能力保持不变。
详细信息，请参见 MSCs 或 EPCs
*我们非常感谢大田大治教授和长野真澄博士的上述分析。
（3）小鼠ES细胞（129SV）的冷冻保存分析
测试细胞系:129SV（鼠ES细胞）
冷冻介质:CELLBANKER 1，1plus，2和STEM-CELLBANKER ®
方案（CELLBANKER ® 系列）
冻存：为了获得最佳结果，冷冻保存的细胞应处于对数生长阶段。可以替代类似或标准的冷冻方案。
1.检查并确保细胞培养物没有污染、处于健康状态和适当的流动性等。
2.进行细胞计数以确定细胞的存活率
3.将细胞轻轻打团离心（3-5分钟，在1000~2000转/分钟，4°C下）。用吸气器除去上清液。
4.用CELLBANKER冷冻保存培养基轻轻悬浮细胞（1毫升用于5x10 5 -5x10 6 细胞）
5.将细胞悬浮液以1毫升的比例分散到已标有细胞系名称、细胞浓度、过渡日期和其他基本信息的冷冻保存瓶中。
6.将小瓶直接置于-80°C储存，如有必要，在小瓶冷冻至少24小时后，将冷冻小瓶转移至液氮储存罐。
重要提示:最佳方案可能因细胞类型而异。
解冻：
1.将冰冻的细胞从储存室中取出，在37°C的摇晃水浴中迅速解冻。
2.立即稀释并轻轻将每1毫升细胞与10毫升完全细胞培养基混合。
3.将细胞轻轻打团离心（3-5分钟，在1，000-2，000转/分钟，4°C下）。取出上清吸附器。
4.用适当体积的完整细胞培养基轻轻悬浮细胞，然后放入培养瓶中。
5.按照标准程序继续进行进一步的培养程序。
（4）使用STEM-CELLBANKER®对小鼠肾脏组织进行低温保存。
将小鼠肾脏切成约5毫米方。组织样本要么立即用10%福尔马林固定，要么在-80°C下用1毫升STEM-CELLBANKER冷冻保存一周。冷冻保存的样本解冻后立即用10%的福尔马琳固定。两个样本的石蜡切片用H&E或抗活性caspase-3抗体染色。新鲜和冷冻保存的小鼠组织样本中坏死或凋亡的迹象微乎其微。在各种小鼠器官的组织样本案例中也得到了类似的结果。
（5）用 STEM-CELLBANKER®冷冻保存细胞后 mRNA 的保存。
从小鼠肺成纤维细胞系的细胞中提取总RNA，无论是在采集后立即提取还是在-80°C下用STEM-CELLBANKER冷冻一周并解冻后提取。通过DNA微阵列分析比较两个样本中的mRNA水平，结果显示93%的mRNA水平在±1.6倍的范围内。
五、质量控制标准
每批次STEM-CELLBANKER® GMP等级产品均通过以下质量检测：
1.理化性质：pH值（7.2±0.2）、渗透压（280-320 mOsm/kg）、外观（无色至淡黄色澄清液体，无沉淀）；
2.无菌性：需氧菌、厌氧菌及真菌培养阴性（培养14天）；
3.内毒素：鲎试剂法检测<0.25 EU/mL；
4.细胞毒性：干细胞复苏后存活率（>85%）、细胞增殖率（72小时内达到对数生长期）；
5.污染物控制：支原体、病毒（如HIV、HBV、HCV）及重金属（铅、汞等）检测阴性。
六、储存与稳定性
在2至8°C或-20°C以下储存，未开封在2至8°C储存时，产品自制造之日起可保持稳定3年。
七、详细使用方法
（1）使用前准备
1.冻存液复苏
•将STEM-CELLBANKER® GMP级冻存液从-80℃冰箱取出，立即置于2-8℃冰箱中缓慢解冻（推荐解冻时间为12-24小时，避免剧烈震荡）。解冻过程中需严格避光，防止光照影响冻存液成分稳定性。
•解冻完成后，肉眼检查冻存液是否澄清、无沉淀或异物，如有异常（如浑浊、结晶未完全溶解），禁止使用。
2.细胞准备
•待冻存细胞需处于对数生长期，活力≥90%，且经无菌检测（如支原体、细菌、真菌）确认阴性。
•按常规细胞培养流程消化、离心（离心条件：1000-1200 rpm，5分钟，室温），弃上清后用预冷的PBS（0.01 M，pH 7.2-7.4）洗涤细胞1-2次，再次离心并彻底去除上清，避免残留培养基影响冻存效果。
3.环境与耗材准备
•在生物安全柜内操作，确保超净台、离心机、冻存管（推荐使用无菌无酶冻存管，容量1-2 mL）等耗材经灭菌处理。
•提前预冷冻存管至4℃，并标记细胞名称、代数、冻存日期及操作者信息。
（2）细胞冻存操作步骤
1.细胞重悬与冻存液混合
•轻柔吹打细胞沉淀，制成单细胞悬液，取少量细胞悬液进行活率计数（如台盼蓝染色法），确保活率符合冻存要求。
•根据细胞计数结果，加入预冷的STEM-CELLBANKER® GMP级冻存液，调整细胞浓度至1×10⁶-1×10⁷ cells/mL（具体浓度根据细胞类型调整，贴壁细胞可适当提高浓度），用移液枪缓慢吹打5-10次，确保细胞与冻存液充分混匀，避免产生气泡。
2.分装与梯度降温
•将混合后的细胞悬液迅速分装至预冷的冻存管中，每管1-1.5 mL，拧紧管盖（避免过紧导致管裂），立即放入程序降温盒（如Nalgene Mr. Frosty），置于-80℃冰箱中梯度降温（降温速率约-1℃/min），静置12-24小时。
•注意：禁止直接将冻存管放入-80℃或液氮中，剧烈降温会导致细胞冰晶损伤；程序降温盒需提前加入异丙醇或按说明书预处理。
3.长期储存
•梯度降温后，将冻存管从-80℃冰箱取出，迅速转移至液氮罐气相区（-196℃）长期保存，记录冻存位置，定期检查液氮液位。
（3）细胞复苏操作步骤
1.冻存管取出与快速解冻
•从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中快速解冻（1-2分钟），期间轻轻晃动冻存管，确保管内液体均匀融化（仅留少量冰晶时取出，避免过度加热）。
•用75%酒精擦拭冻存管外壁，移入生物安全柜内。
2.细胞洗涤与培养
•在离心管中预先加入5-10mL预温（37℃）的完全培养基（根据细胞类型选择，如DMEM、RPMI-1640等），将解冻后的细胞悬液缓慢滴入离心管，轻柔混匀，避免细胞受到渗透压冲击。
•离心（1000rpm，5分钟，室温），弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞，接种至培养皿/瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。
•24小时后更换新鲜培养基，去除死细胞及残留冻存液，后续按常规细胞培养流程进行换液和传代。
（4）注意事项
1.无菌操作：全程严格遵守GMP级操作规范，避免污染；冻存液开封后建议一次性使用，若需分装，应在无菌条件下进行，分装后-20℃保存，避免反复冻融（≤3次）。
2.细胞状态：确保冻存前细胞活力高、无污染，避免在细胞汇合度过高（>90%）或生长停滞期冻存。
3.温度控制：冻存液及细胞悬液需始终保持低温（2-8℃），操作时间尽量缩短，减少细胞暴露于室温的时间。
4.兼容性：STEM-CELLBANKER® GMP级冻存液适用于多种干细胞（如间充质干细胞、胚胎干细胞）及贴壁/悬浮细胞，无需额外添加血清或DMSO，具体细胞类型的适用性可参考产品说明书或进行预实验验证。
5.安全防护：操作液氮时佩戴防冻手套、护目镜，避免冻伤；冻存管取出时先检查是否有裂纹，防止液氮泄漏导致爆炸。
八、参考文献
Shimazu et al. (2015) Serum- and xeno-free cryopreservation of human umbilical cord tissue as mesenchymal stromal cell source. Cytotherapy, 2015; 17: 593 - 600.
Nakagawa M et al. (2014) A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports 4 Article, number:359.
Miyamoto Y et al. (2012) Cryopreservation of Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Medicine., Vol. 3, pp. 89-95, 2012.
Saliem M et al. (2012) Improved cryopreservation of human hepatocytes using a new xeno free cryoprotectant solution. World J Hepatol. May 27;4(5):176-83.
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Nakamura A et al. (2010) Human primary cultured hepatic stellate cells can be cryopreserved. Med Mol Morphol. 43:107-115.
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