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名称
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品牌
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货号
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规格
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保存
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HisTrap HP带His标签的蛋白质纯化层析柱
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Cytiva
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17524801
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1x5mL
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4至30℃
20%乙醇
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一、产品概述
HisTrap HP预装式层析柱提供了一种快速、便捷且可复现的规格，用以对带组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白质进行制备纯化。
•高分辨率：填料粒径小（平均填料粒径为 34 µm）。
•结合载量高：至少 40 mg 带 His 标签的蛋白/mL 层析填料，以实现高收率。
•镍脱落量可忽略不计：有助于保持活性并最大程度地减少蛋白质沉淀。
•相容多种试剂：适合与各种还原剂、去污剂、变性剂和其他添加剂配合使用。
•便捷的HiTrap规格:1mL和5mL层析柱与注射器、蠕动泵或层析系统(例如ÄKTA或其他FPLC系统)兼容。
二、核心优势
在对带His标签的蛋白质进行纯化方面，IMAC 不仅应用广泛，而且非常高效。HisTrap HP层析柱填充有Ni Sepharose High Performance（HP）亲和层析填料。该层析填料由其上偶联有螯合基团的高度交联琼脂糖基架组成。该螯合基团预装有镍，可选择性地结合带有裸露组氨酸基团的蛋白。
HisTrap HP IMAC 层析填料的结合载量达到40mg/mL以上，可实现高蛋白回收率。与大基架尺寸相比，基架尺寸小(34µm)的镍层析填料更利于提高分辨率。
三、产品规格
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HisTrap HP，1 x 5 mL
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层析技术
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组氨酸标记蛋白纯化
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柱床尺寸
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16×25毫米
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柱床高度
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25毫米
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柱床体积
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5
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结合载量/层析柱
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至少 40 mg 带组氨酸标签的蛋白质/mL 培养基
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柱内径
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16毫米
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流速
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4毫升/分钟（1毫升），5毫升/分钟（5毫升）
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许可
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有关许可信息，请参阅“关于我们”部分中的许可声明页
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压力最大值（操作时填充床压力）
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5巴[0.5兆帕]（70 psi）
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储存
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4至30℃;20%乙醇
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四、产品应用
HisTrap HP层析柱用途广泛，包括：
•纯化His标记的膜蛋白以研究脂质结合
•纯化带His标签的蜘蛛毒素及其变体，用以结果分析钠通道抑制
五、产品操作说明
（1）缓冲液制备
用于缓冲液制备的水和化学品应为高纯度。使用前通过0.22μm或0.45μm过滤器过滤缓冲液。
使用高纯度咪唑，这将使280 nm处的吸光度极低或无吸光度。
若重组组氨酸标签蛋白以包涵体形式表达，则在所有缓冲液及样品中加入6M鸟氨酸盐酸盐（Gua-HCl）或8M尿素。变性蛋白可能在色谱柱上发生复性。
（2）Ni2+渗漏
在所有正常条件下，Ni Sepharose High Performance的Ni2+泄漏量较低。该泄漏量低于其他受试IMAC介质。对于非常关键的应用，通过在加载样品前执行空白运行（如下所述），可进一步降低纯化过程中的泄漏量。
注：在使用含还原剂的缓冲液/样品前，需先进行无还原剂的空白运行。同样地，在关键纯化过程中，为最大限度减少金属离子泄漏，建议进行空白运行。使用不含还原剂的结合缓冲液和洗脱缓冲液。
空白运行步骤：
1.用5倍柱体积（CV）的蒸馏水冲洗色谱柱。
2.用5 CV洗脱缓冲液洗涤。
3.用10 CV结合缓冲液平衡。
注：Ni Sepharose High Performance与还原剂相容。但是，建议在添加含还原剂的缓冲液/样品前，先进行空白运行（如上所述）以去除任何弱结合的Ni2+离子。未使用时，不要将HisTrap HP色谱柱与含还原剂的缓冲液一起放置。
（3）样品制备
如需获得重组组氨酸标签克隆的最佳生长、诱导及细胞裂解条件，请参阅既定操作规程。
通过以下方式将样品调整至结合缓冲液的组成和pH：
• 添加缓冲液、氯化钠、咪唑以及来自浓缩原液的添加剂
• 用结合缓冲液稀释样本
• 缓冲液交换
不要使用强碱或强酸调节pH值（有沉淀风险）。在将样品加到色谱柱之前，立即通过0.22μm或0.45μmfilter过滤和/或离心样品。
为防止宿主细胞蛋白与暴露的组氨酸结合，必须在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑。
（4）纯化
步骤操作：
1.用蒸馏水灌注注射器或泵管路。
2.移除塞子，并将色谱柱与注射器（使用提供的鲁尔连接器）、实验室泵或色谱系统管路以“滴接”方式连接，以避免向系统中引入空气。
3.移除立柱出口处的卡扣。
4.用3至5倍柱体积的蒸馏水冲洗色谱柱。
5.用至少5个柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。推荐流速分别为1ml/min或5ml/min（针对1ml和5 ml色谱柱）。在某些情况下，建议在最终平衡/样品应用前进行空白运行。
6.使用注射器或泵施用预处理样本。
7.用结合缓冲液洗涤直至吸光度达到稳定基线（通常至少10至15个柱体积）。使用咪唑作为样品和结合缓冲液可改善纯化结果。
8.采用一步法或线性梯度洗脱缓冲液进行洗脱。若目标蛋白通过一步梯度洗脱，通常5个柱体积即可满足需求。浅梯度（例如线性梯度）20个柱体积或更多，可分离结合强度相似的蛋白质。
注：如果需要从蛋白质中去除咪唑，根据样本体积使用HiTrap脱盐、PD-10脱盐柱或HiPrep 26/10脱盐。
（5）剥脱和再充填
注：如果要纯化相同的蛋白质，则该柱子在每次纯化之间不需要剥离和再充电；根据细胞提取物、提取体积、目标蛋白质等，只需在5至7次纯化后剥离和再充电即可。
1.剥离
推荐的剥离缓冲液：20 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，50 mM EDTA，pH 7.4
用至少5至10个柱体积的洗脱缓冲液冲洗色谱柱以进行脱附。在重新装柱前，用至少5至10个柱体积的结合缓冲液和5至10个柱体积的蒸馏水进行洗涤。
2.再充填
分别在HisTrapHP1ml和5ml色谱柱上加0.5ml或2.5ml0.1MNiSO4的蒸馏水，对水洗色谱柱进行再充填。也可使用其他金属盐、氯化物或硫酸盐。
用5倍柱体积的蒸馏水和5倍柱体积的结合缓冲液（用于调节pH）洗涤后，置于20%乙醇中保存。
（6）清洗
当观察到背压升高时，应清洗色谱柱。清洗前，按照“剥脱和再充填”中描述的推荐程序脱除Ni2+离子。
清洗后，将样品保存于20%乙醇中（用5倍柱体积的乙醇冲洗）或在乙醇保存前补充Ni2+。经Ni2+脱附的色谱柱可通过以下原位清洗（CIP）方案进行清洗：
1.离子结合蛋白：用1.5 M氯化钠的数倍柱体积洗涤；然后用约10倍柱体积的蒸馏水洗涤。
2.沉淀蛋白、疏水结合蛋白及脂蛋白：用1 M氢氧化钠洗涤柱子，接触时间通常为1至2小时（去除内毒素需12小时或更长时间）。然后用约10倍柱体积的结合缓冲液洗涤，再用5至10倍柱体积的蒸馏水洗涤。
3.疏水结合蛋白、脂蛋白和脂质：用5至10倍柱体积的30%异丙醇洗涤约15至20分钟，随后用约10倍柱体积的蒸馏水洗涤。或采用碱性/酸性溶液洗涤，用量为2个柱体积的去污剂。例如使用0.1%至0.5%的非离子型去污剂（溶于0.1 M乙酸）处理1至2小时。处理后，务必用至少5个柱体积的70%乙醇1冲洗以去除残留去污剂，随后用约10个柱体积的蒸馏水冲洗。
（7）故障排除
注：使用高浓度尿素或盐酸胍时，通常会发生蛋白质解折叠。柱上（或洗脱后）复性取决于蛋白质。
小贴士：为减少样本稀释，可添加固态尿素或盐酸胍（GuaHCl）。
提示：含尿素的样本可直接进行SDS-PAGE分析，而含Gua-HCl的样本需在SDS-PAGE前用含尿素的缓冲液进行缓冲液交换。
1.柱堵塞
• 样本中的细胞碎片可能会堵塞色谱柱。请按照第7章“就地清洗”第16页的说明清洗色谱柱。
• 离心和/或通过0.22 μm 或0.45 μmfilter 过滤样品，参见第11页的样品制备。
2.样本粘稠度过高
• 如果裂解液因宿主核酸浓度过高而非常粘稠，继续超声处理直至粘度降低，和/或加入DNase I至5 μg/ml，Mg2+至1 mM，并在冰上孵育10至15分钟。或者，用注射器针头多次抽吸裂解液。
3.蛋白质在纯化过程中难以溶解或发生沉淀
• 可使用的还原剂、去污剂、甘油和变性剂。
添加助溶剂后需轻柔混合30分钟以促进标记蛋白溶解（包涵体可能需要更长时间混合）。需注意Triton X-100和NP-40（但非Tween）在280nm处具有高吸光度。此外，缓冲液置换难以有效去除去垢剂。
4.纯化组分中未检出组氨酸标签蛋白
• 洗脱条件过于温和（组氨酸标签蛋白仍结合）：通过增加咪唑梯度或降低pH值进行洗脱，以确定最佳洗脱条件。
• 蛋白质已在柱中沉淀：在下一次实验中，减少样品量，或通过线性咪唑梯度洗脱而非咪唑梯度洗脱来降低蛋白质浓度。尝试使用不同去污剂或改变氯化钠浓度，或在变性（解折叠）条件下洗脱（添加4至8 M尿素或4至6 M GuaHCl）。
• 非特异性疏水或其他相互作用：向洗脱缓冲液（e.g.，0.2% Triton X-100）中添加非离子型去污剂或增加氯化钠浓度。
• 样品和/或结合缓冲液中咪唑浓度过高：蛋白质存在于流过物料中。降低咪唑浓度。
• 组氨酸标签可能暴露不足：在流穿材料中发现该蛋白；按照包涵体的尿素或Gua-HCl进行未折叠蛋白纯化。
• 缓冲液/样品成分不正确：蛋白质存在于流穿材料中。检查pH和样品及结合缓冲液的成分。确保样品中螯合剂或强还原剂的浓度不超过过高，并且咪唑的浓度也不过高。
在细菌裂解液制备过程中收集的样本进行SDS-PAGE电泳分析可能表明，大部分组氨酸标签蛋白位于离心沉淀中。可能的原因及解决方案如下：
• 超声处理可能不充分：可通过显微镜检查或测量A260处核酸释放量来验证细胞破碎情况。添加溶菌酶（最多
在超声处理前，使用0.1体积的10 mg/ml溶菌酶溶液（溶于25 mM TrisHCl，pH 8.0）可能改善结果。避免起泡和过热，因为这可能导致目标蛋白变性。过度超声处理还可能导致宿主蛋白与目标蛋白共纯化。
• 该蛋白质可能不溶（包涵体）：通常可使用常见变性剂（如4至6 M Gua-HCl、4至8 M尿素或强去污剂）从包涵体中溶解（并解折叠）该蛋白质。制备含有20 mM磷酸钠、8 M尿素或6 M Gua-HCl及适当咪唑浓度（pH 7.4至7.6）的缓冲液。含尿素的缓冲液还应包含500 mM氯化钠。使用这些缓冲液进行样品制备、作为结合缓冲液和洗脱缓冲液。对于样品制备和结合缓冲液，使用10至20 mM咪唑或优化试验（包括尿素或Gua-HCl）中选定的浓度。
5.洗脱蛋白未达到纯化标准（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示多条条带）
• 蛋白酶对标记蛋白的部分降解：添加蛋白酶抑制剂（谨慎使用EDTA）。
• 污染物对镍离子具有高亲和力：采用阶梯式或线性咪唑梯度洗脱，以确定结合和洗涤的最佳咪唑浓度；将样品中咪唑浓度与结合缓冲液保持一致。在用结合缓冲液洗脱前，需用含尽可能高浓度咪唑的缓冲液进行洗涤，避免导致标记蛋白洗脱。浅层咪唑梯度（20个柱体积或更多）可能分离结合强度相似的蛋白质。若优化条件未能去除污染物，则可能需要通过离子交换色谱（HiTrap Q HP或HiTrap SP HP）和/或凝胶过滤（Superdex™ Peptide、Superdex 75或Superdex 200）进行进一步纯化。
• 污染物与标记蛋白相关联：
在超声处理细胞前添加去污剂和/或还原剂。增加去污剂浓度（例如高达2% Triton X-100或2% Tween 20），或向洗涤缓冲液中添加甘油（高达50%）以破坏非特异性相互作用。
6.组氨酸标签蛋白在样品上样/洗涤过程中被分离
• 缓冲液/样品成分不正确：检查pH值和样品及结合缓冲液的成分。确保样品中螯合剂或强还原剂的浓度不超过过高，并且咪唑的浓度也不过高。
• 组氨酸标签部分阻断：在变性条件下纯化（使用4至8 M尿素或4至6 M GuaHCl）。
• 超过色谱柱容量：将两根或三根HisTrap HP 1 ml色谱柱连接在一起，或更换为一根HisTrap HP 5 ml色谱柱。
六、存储
HisTrap HP层析柱保存于4℃至30℃的20%乙醇溶液中。
北京
